Besluit erkenningsvoorwaarden en werkwijzen laboratoria (PPE) 2009

[Regeling vervallen per 01-01-2015.]
[Regeling materieel uitgewerkt per 01-01-2012.]
Geraadpleegd op 08-05-2024.
Geldend van 01-01-2010 t/m 19-02-2011

Besluit van het Productschap Pluimvee en Eieren van 29 oktober 2009 houdende voorwaarden voor de erkenning van laboratoria alsmede voorschriften met betrekking tot de werkwijze (Besluit erkenningsvoorwaarden en werkwijzen laboratoria (PPE) 2009)

Het bestuur van het Productschap Pluimvee en Eieren;

Gelet op artikel 4, zesde, zevende, achtste en tiende lid van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveehouderij (PPE) 2007 alsmede artikel 4, zesde lid, van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie (PPE) 2007 alsmede artikel 4, vijfde, zesde en tiende lid van de Verordening hygiënevoorschriften kalkoenhouderij (PPE) 2009;

Besluit:

Artikel 1

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Dit besluit neemt de terminologie, als omschreven in artikel 1 van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveehouderij (PPE) 2007, artikel 1 van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie (PPE) 2007 en artikel 1 van de Verordening hygiënevoorschriften kalkoenhouderij (PPE) 2009 over en verstaat daarnaast onder branchemethode: de door het bestuur vastgestelde methode voor de detectie of serotypering van monsters en verstaat onder pluimvee mede kalkoenen.

Artikel 2

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

1 De voorzitter kan een laboratorium erkennen voor de detectie van Salmonella in de matrices mest, vlees of dons afkomstig van pluimvee indien het laboratorium naar zijn oordeel voldoet aan de in bijlage I opgenomen erkenningsvoorwaarden.

2 De voorzitter kan een laboratorium erkennen voor de serotypering van Salmonella-isolaten indien het laboratorium naar zijn oordeel voldoet aan de in bijlage II opgenomen erkenningsvoorwaarden.

3 De voorzitter kan een laboratorium erkennen voor de detectie van Campylobacter in de matrices mest of vlees indien het laboratorium naar zijn oordeel voldoet aan de in bijlage III opgenomen erkenningsvoorwaarden.

Artikel 3

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Een laboratorium dat door de voorzitter op grond van artikel 2 erkend is, blijft voldoen aan de erkenningsvoorwaarden als bedoeld in de bijlagen I, II of III.

Artikel 4

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

1 De voorzitter kan de erkenning van een laboratorium schorsen voor een door hem te bepalen termijn indien het laboratorium niet voldoet aan één of meer van de erkenningsvoorwaarden als bedoeld in de bijlagen I, II of III.

2 In geval van een schorsing van de erkenning als bedoeld in het eerste lid, voert het laboratorium de activiteit waarvoor het geschorst is niet uit onder de betreffende erkenning.

3 De voorzitter kan de erkenning van een laboratorium geheel of gedeeltelijk intrekken indien:
- a. het laboratorium zich niet houdt aan het bepaalde in het tweede lid;
- b. indien het laboratorium detectie en serotypering uitvoert in het kader van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveehouderij (PPE) 2007, de Verordening hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie (PPE) 2007 of de Verordening hygiënevoorschriften kalkoenhouderij (PPE) 2009, zonder dat het een erkenning heeft voor de betreffende detectie en serotypering;
- c. na afloop van de schorsingstermijn, bedoeld in het eerste lid, blijkt dat het laboratorium nog steeds niet voldoet aan één of meer erkenningsvoorwaarden als bedoeld in de bijlagen I, II of III;
- d. blijkt dat binnen een periode van twaalf maanden na afloop van de schorsingstermijn, bedoeld in het eerste lid, het laboratorium opnieuw niet voldoet aan één of meer van de erkenningsvoorwaarden als bedoeld in de bijlagen I, II of III;
- e. het laboratorium niet voldoet aan één of meer erkenningsvoorwaarden als bedoeld in de bijlagen I, II of III, of naar het oordeel van de voorzitter afbreuk is gedaan aan de correctheid en betrouwbaarheid van de resultaten van het door het laboratorium uitgevoerde onderzoek.

4 Voordat een besluit tot schorsing of intrekking wordt genomen, stelt de voorzitter het laboratorium in de gelegenheid om binnen een redelijke termijn alsnog aan de erkenningsvoorwaarden als bedoeld in de bijlagen I, II of III te voldoen.

5 In afwijking van het bepaalde in het vierde lid kan de voorzitter de erkenning met onmiddellijke ingang intrekken indien sprake is van een situatie als bedoeld in het derde lid, onderdeel d., en het belang van de dier- en volksgezondheid een intrekking met onmiddellijke ingang vereist.

6 In afwijking van het bepaalde in het vierde lid kan de voorzitter de erkenning met onmiddellijke ingang schorsen of intrekken indien het belang van de dier- en volksgezondheid een schorsing of intrekking met onmiddellijke ingang vereist.

Artikel 5

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

1 Het laboratorium voert de detectie van Salmonella uit overeenkomstig de daartoe vastgestelde methoden, opgenomen in bijlage IV.

2 Het laboratorium voert de serotypering van Salmonella uit overeenkomstig de daartoe vastgestelde methoden, opgenomen in bijlage IV.

3 Het laboratorium voert de detectie van Campylobacter uit overeenkomstig de daartoe vastgestelde methoden, opgenomen in bijlage IV.

Artikel 6

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

1 Het nationaal referentielaboratorium voor de detectie van Salmonella is een erkend laboratorium voor de detectie van Salmonella als bedoeld in dit besluit.

2 Het nationaal referentielaboratorium voor de serotypering van Salmonella isolaten is een erkend laboratorium voor de serotypering van Salmonella isolaten als bedoeld in dit besluit.

3 Het nationaal referentielaboratorium voor de detectie van Campylobacter is een erkend laboratorium voor de detectie van Campylobacter als bedoeld in dit besluit.

Artikel 7

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Het laboratorium voert de detectie van Salmonella, de serotypering van Salmonella-isolaten of de detectie van Campylobacter uit op verzoek van de ondernemer.

Artikel 8

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Het laboratorium verleent medewerking aan controles, welke kunnen worden uitgevoerd in opdracht van de voorzitter.

Artikel 9

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

1 Het Besluit erkenningsvoorwaarden en werkwijzen laboratoria (PPE) 2007 wordt ingetrokken.

2 Elke verwijzing naar het Besluit erkenningsvoorwaarden en werkwijzen laboratoria (PPE) 2007 in de regelgeving van het productschap wordt geacht te verwijzen naar het Besluit erkenningsvoorwaarden en werkwijzen laboratoria (PPE) 2009.

Artikel 10

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

1 Dit besluit wordt aangehaald als: Besluit erkenningsvoorwaarden en werkwijzen laboratoria (PPE) 2009.

2 Dit besluit treedt in werking op 1 januari 2010.

Zoetermeer, 29 oktober 2009

J.J. Ramekers

voorzitter

B.M. Dellaert

secretaris

Bijlage I. Erkenningsvoorwaarden voor laboratoria die de detectie van Salmonella uitvoeren

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

A. Een laboratorium dat erkend wil worden dient een schriftelijke aanvraag voor een erkenning in bij het productschap. Deze aanvraag dient de volgende gegevens te bevatten:

naam laboratorium

naam contactpersoon

vestigingsadres

telefoonnummer

e-mailadres

gewenste erkenning

accreditatie-certificaat
B. Het laboratorium beschikt voor de detectie van Salmonella over een door de Raad voor Accreditatie verleend accreditatie-certificaat op basis van de norm NEN-EN-ISO/IEC 17025. De scope van de accreditatie moet toereikend zijn voor de matrices waarin de detectie wordt uitgevoerd. De kosten voor het behalen van de betreffende scope zijn voor rekening van het laboratorium. Het laboratorium toont jaarlijks in de maand juni aan dat het nog steeds beschikt over het juiste accreditatie-certificaat met bijbehorende scope, startend in het jaar volgend op het jaar van de erkenning.
C. Vermelding op het accreditatie-certificaat geschiedt overeenkomstig Bijlage IV hoofdstuk 2.
D. Indien het laboratorium is gevestigd buiten Nederland toont het laboratorium aan dat het beschikt over een, gelijkwaardig aan het onder B. genoemde, accreditatie-certificaat, afgegeven door de daartoe bevoegde autoriteit van de staat van herkomst.
E. Voor de detectie van Salmonella maakt het laboratorium gebruik van de branchemethoden, opgenomen in Bijlage IV. Nieuwe methoden kunnen worden ingediend bij het productschap, om als branchemethoden te kunnen worden toegepast. Na beoordeling beslist het bestuur of deze methoden als branchemethoden kunnen worden vastgesteld.
F. Het laboratorium gebruikt één van de toegelaten methoden per micro-organisme-matrix combinatie. Hierbij wordt tevens gelet op de herkomst van het monster. Om te kunnen serotyperen dient echter bij toepassing van één van de snelle Salmonella branchemethoden een positief monster wel te worden geïsoleerd door middel van de MSRV-methode (traditionele kweekmethode).
G. Indien het laboratorium bij toepassing van een snelle branchemethode een positieve bevinding doet, en de Salmonella-stam ten behoeve van de serotypering niet verder geïsoleerd kan worden, moet op het analysecertificaat hiervan melding worden gemaakt.
H. Het laboratorium neemt deel aan ieder Salmonella detectie-ringonderzoek, georganiseerd door het nationaal referentielaboratorium Salmonella, in het kader van het Besluit erkenningsvoorwaarden en werkwijzen laboratoria (PPE) 2009. De kosten voor het Salmonella detectie-ringonderzoek zijn voor rekening van het laboratorium
I. De resultaten van het Salmonella detectie-ringonderzoek van het laboratorium voldoen aan de norm van het productschap welke is opgenomen in Bijlage VI.
J. Het laboratorium geeft de uitslag van de detectie, indien deze negatief is, binnen 10 werkdagen nadat de uitslag van de detectie bekend is, door aan het productschap. Het laboratorium doet dit op de door het productschap voorgeschreven wijze.
K. Het laboratorium geeft de uitslag van de detectie, indien deze positief is, én de uitslag van de serotypering binnen 24 uur nadat de uitslag van de serotypering bekend is door aan het productschap. Het laboratorium doet dit op de door het productschap voorgeschreven wijze.
L. Het laboratorium mag alleen werkzaamheden uitbesteden aan een ander voor de beoogde werkzaamheden erkend laboratorium.
M. Het laboratorium houdt alle informatie die het verkrijgt en waarvan het de vertrouwelijkheid kent of behoort te kennen, behoudens voorafgaande schriftelijke toestemming van de ondernemer, geheim, voor zover wetgeving zich hiertegen niet verzet.

Bijlage II. Erkenningsvoorwaarden voor laboratoria die de serotypering van Salmonella isolaten uitvoeren

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

A. Een laboratorium dat erkend wil worden dient een schriftelijke aanvraag voor een erkenning in bij het productschap. Deze aanvraag dient de volgende gegevens te bevatten:

naam laboratorium

naam contactpersoon

vestigingsadres

telefoonnummer

e-mailadres

gewenste erkenning

accreditatiecertificaat
B. Het laboratorium beschikt voor de serotypering van Salmonella isolaten over een door de Raad voor Accreditatie verleend accreditatie-certificaat op basis van de norm NEN-ENISO/ IEC 17025. De scope van de accreditatie moet de serotypen die het laboratorium kan typeren vermelden. De kosten voor het behalen van de betreffende scope zijn voor rekening van het laboratorium. Het laboratorium toont jaarlijks in de maand juni aan dat het nog steeds beschikt over het juiste accreditatie-certificaat met bijbehorende scope, startend in het jaar volgend op het jaar van de erkenning.
C. Vermelding op het accreditatie-certificaat geschiedt overeenkomstig Bijlage IV hoofdstuk 2.
D. Indien het laboratorium is gevestigd buiten Nederland toont het laboratorium aan dat het beschikt over een, gelijkwaardig aan het onder B. genoemde, accreditatie-certificaat, afgegeven door de daartoe bevoegde autoriteit van de staat van herkomst.
E. Voor de serotypering van Salmonella maakt het laboratorium gebruik van de branchemethoden, opgenomen in Bijlage IV. Nieuwe methoden kunnen worden ingediend bij het productschap, om als branchemethode te kunnen worden toegepast. Na beoordeling beslist het bestuur of deze methoden als branchemethoden kunnen worden vastgesteld.
F. Het laboratorium neemt deel aan ieder Salmonella serotypering-ringonderzoek, georganiseerd door het nationaal referentielaboratorium Salmonella serotypering, in het kader van het Besluit erkenningsvoorwaarden en werkwijzen laboratoria (PPE) 2009. De kosten voor het Salmonella serotypering-ringonderzoek zijn voor rekening van het laboratorium.
G. De resultaten van het Salmonella serotypering-ringonderzoek van het laboratorium dienen te voldoen aan de norm van het productschap zoals opgenomen in Bijlage VI.
H. Het laboratorium dat de serotypering uitvoert typeert tevens de isolaten afkomstig van een erkend laboratorium dat geen dan wel een beperkt aantal serotypen bepaalt.
I. Het laboratorium hanteert bij het uitwisselen van de resultaten van de serotypering een door het productschap vastgestelde code voor de verschillende serotypen Salmonella.
J. Het laboratorium mag alleen werkzaamheden uitbesteden aan een ander voor de beoogde werkzaamheden erkend laboratorium.
K. Het laboratorium houdt alle informatie die het verkrijgt en waarvan het de vertrouwelijkheid kent of behoort te kennen, behoudens voorafgaande schriftelijke toestemming van de ondernemer, geheim, voor zover wetgeving zich hiertegen niet verzet.

Bijlage III. Erkenningsvoorwaarden voor laboratoria die de detectie van Campylobacter uitvoeren

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

A. Een laboratorium dat erkend wil worden dient een schriftelijke aanvraag voor een erkenning in bij het productschap. Deze aanvraag dient de volgende gegevens te bevatten:

naam laboratorium

naam contactpersoon

vestigingsadres

telefoonnummer

e-mailadres

gewenste erkenning

accreditatiecertificaat
B. Het laboratorium beschikt voor de detectie van Campylobacter over een door de Raad voor Accreditatie verleend accreditatie-certificaat op basis van de norm NEN-ENISO/ IEC 17025. De scope van de accreditatie moet toereikend zijn voor de matrices waarin de detectie wordt uitgevoerd. De kosten voor het behalen van de betreffende scope zijn voor rekening van het laboratorium. Het laboratorium toont jaarlijks in de maand juni aan dat het nog steeds beschikt over het juiste accreditatie-certificaat met bijbehorende scope, startend in het jaar volgend op het jaar van de erkenning.
C. Vermelding op het accreditatie-certificaat geschiedt overeenkomstig Bijlage IV hoofdstuk 2.
D. Indien het laboratorium is gevestigd buiten Nederland toont het laboratorium aan dat het beschikt over een, gelijkwaardig aan het onder B. genoemde, accreditatie-certificaat, afgegeven door de daartoe bevoegde autoriteit van de staat van herkomst.
E. Voor de detectie van Campylobacter maakt het laboratorium gebruik van de branchemethoden, opgenomen in Bijlage IV. Nieuwe methoden kunnen worden ingediend bij het productschap, om als branchemethoden te kunnen worden toegepast. Na beoordeling beslist het bestuur of deze methoden als branchemethoden kunnen worden vastgesteld.
F. Het laboratorium gebruikt één van de toegelaten methoden per micro-organisme-matrix combinatie. Hierbij wordt tevens gelet op de herkomst van het monster.
G. Het laboratorium neemt deel aan ieder Campylobacter detectie-ringonderzoek, georganiseerd door het nationaal referentielaboratorium Campylobacter, in het kader van het Besluit erkenningsvoorwaarden en werkwijzen laboratoria (PPE) 2009. De kosten voor het Campylobacter detectie-ringonderzoek zijn voor rekening van het laboratorium.
H. De resultaten van het Campylobacter detectie-ringonderzoek van het laboratorium dienen te voldoen aan de norm van het productschap zoals opgenomen in Bijlage VI.
I. Het laboratorium geeft de uitslag van de detectie binnen 10 werkdagen nadat de uitslag van de detectie bekend is, door aan het productschap. Het laboratorium doet dit op de door het productschap voorgeschreven wijze.
J. Het laboratorium mag alleen werkzaamheden uitbesteden aan een ander voor de beoogde werkzaamheden erkend laboratorium.
K. Het laboratorium houdt alle informatie die het verkrijgt en waarvan het de vertrouwelijkheid kent of behoort te kennen, behoudens voorafgaande schriftelijke toestemming van de ondernemer, geheim, voor zover wetgeving zich hiertegen niet verzet.

Bijlage IV

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Hoofdstuk 1. Methoden voor de detectie van Salmonella in mest, vlees en dons afkomstig van pluimvee en de detectie van Campylobacter in mest en vlees afkomstig van pluimvee en de serotypering van Salmonella-isolaten

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Voor de detectie en serotypering van Salmonella en de detectie van Campylobacter in de pluimveesector staan de volgende door het bestuur vastgestelde branchemethoden ter beschikking. De methoden zijn opgenomen in de volgende hoofdstukken van Bijlage IV.

Hoofdstuk 3
PVE-SALMONELLA-MSRV-291009	PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van MSRV in dons, mest en vlees afkomstig van pluimvee.

Hoofdstuk 4
PVE-SALMONELLA-SERO-291009	PVE branchemethode voor de serotypering van Salmonella volgens het White-Kauffmann-Le Minor schema.

Hoofdstuk 5
PVE-SALMONELLA-VIDAS-140607	PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van VIDAS SLM in dons afkomstig van pluimvee.

Hoofdstuk 6
PVE-SALMONELLA-IQ-II-291009	PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van iQ Check II^TM Salmonella realtime PCR in dons, mest en vlees afkomstig van pluimvee.

Hoofdstuk 7
PVE-CAMPYLOBACTER-PRESTON-140607	PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter met behulp van Preston en CCDA in mest en vlees, afkomstig van pluimvee.

Hoofdstuk 8
PVE-CAMPYLOBACTER-VIDAS-140607	PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter met behulp van VIDAS CAM in vlees, afkomstig van pluimvee.

Hoofdstuk 2. Voorgeschreven vermeldingen op het accreditatie-certificaat

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Voor vermelding op het accreditatie-certificaat dient het laboratorium de volgende notatiewijze voor te dragen.

Nr.	Materiaal of product	Verrichting / Onderzoeksmethode	Intern referentienummer
1	Dons, mest en vlees afkomstig van pluimvee	Aantonen van Salmonella; grensreactie, MSRV	Voorschrift nummer instelling conform PVE-Salmonella- MSRV-291009
2	Dons afkomstig van pluimvee	Aantonen van Salmonella; grensreactie, VIDAS SLM	Voorschrift nummer instelling conform PVE-Salmonella- VIDAS-140607
3	Dons, mest en vlees afkomstig van pluimvee	Aantonen van Salmonella; grensreactie, iQ Check II real-time PCR	Voorschrift nummer instelling conform PVE-Salmonella- IQ-II-291009
4	Salmonella isolaten uit pluimvee	Serotypering van Salmonella; agglutinatiereactie volgens White-Kauffmann-Le Minor schema bijv.: S.Java, S.Typhimurium, S.Livingstone, S.Heidelberg, en S.Virchow	Voorschrift nummer instelling conform PVE-Salmonella- Sero-291009
5	Mest en vlees afkomstig van pluimvee	Aantonen van Campylobacter; grensreactie, Preston en CCDA	Voorschrift nummer instelling conform PVECampylobacter- Preston- 140607
6	Vlees afkomstig van pluimvee	Aantonen van Campylobacter; grensreactie, VIDAS CAM	Voorschrift nummer instelling conform PVECampylobacter- VIDAS- 140607

Hoofdstuk 3. PVE-SALMONELLA-MSRV-291009

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Paragraaf 1. PVE Branchemethode voor de detectie van Salmonella met behulp van MSRV in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

1. Onderwerp

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Deze paragraaf beschrijft een methode voor de detectie van Salmonella in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee.

De versie van de hier beschreven PVE Branchemethode MSRV is gebaseerd op Annex D van ISO 6579.

2. Definities

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Salmonella: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze.

3. Principe

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Na voorincubatie van de te onderzoeken matrix in een voorophopingsmedium, wordt geënt op een half-vast medium, waarna wordt afgestreken op een selectief isolatiemedium, met aansluitend biochemische bevestiging en serotypering.

4. Reagentia en andere materialen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in paragraaf 1 (hieronder). Er mag echter ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn.Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn. Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218:2007

Niet-selectief voorophopingsmedium
gebufferd pepton water	BPw	paragraaf 2.1
Selectief ophopingsmedium
modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium	MSRV	paragraaf 2.2
Selectieve agar
xylose lysine desoxycholaat agar	XLD	paragraaf 2.3
Bevestigingsmedia
ureumagar	UA	paragraaf 2.4
triple-sugar-ironagar	TSI	paragraaf 2.5
lysine-decarboxylase medium	LDC	paragraaf 2.6

5. Apparatuur en glaswerk

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Gebruikelijke apparatuur en glaswerk voor een microbiologisch laboratorium en in het bijzonder de onderstaande:

5.1 Broedstoof voor het bebroeden bij 37 °C ± 1 °C
5.2 Broedstoof voor het bebroeden bij 41,5 °C ± 1 °C
5.3 Waterbad ingesteld op 47 – 50 °C
5.4 Steriele entnaalden met een oog (öses) van ca 1 μl.
5.5 Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml.
5.6 Petrischalen met een middellijn van ca 9 cm.
5.7 Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm.

Opmerking:

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

6. Werkwijze

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

6.1 Algemeen

Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-8°C) te worden aangeleverd. Zie voor de ontvangst van monsters en registratie van afwijkingen bijlage V. De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur na monstername op het laboratorium aanwezig zijn, dient het monster uiterlijk 48 uur + 4 uur na het tijdstip van monstername ingezet te worden.

Stel monsters zo min mogelijk bloot aan temperatuurschommelingen.

Opmerking:

Komen mestmonsters mee met vleesmonsters in een koelbox, sla dan alle monsters gekoeld op. Worden mestmonsters per post ongekoeld verstuurd, sla dan op bij kamertemperatuur, tenzij deze monsters pas de volgende dag worden ingezet.

6.2 Voorbehandeling van het monster

Voeg zoveel BPw (kamertemperatuur) toe aan het monster zodat het monster (minimaal) 1:10 verdund wordt (bijvoorbeeld 25 g monster in 225 ml BPw).

Een ruimere verdunning dan 1:10 is toegestaan, een kleinere verdunning niet.

Opmerking:

Conform Verordening (EG) nr. 0646/2007 is het toegestaan om 2 paar overschoentjes te poolen tot 1 monster en hieraan 225 ml BPw toe te voegen.

In Tabel 1 is ter illustratie de relatie tussen de verschillende monsterhoeveelheden en het volume BPw weergegeven:

Tabel 1. Voorbeelden van de mogelijke monsterhoeveelheden in relatie tot het volume BPw.
aantallen	hoeveelheid (circa)	BPw
15 swabs	7,5 gram	67,5 ml
20 swabs	10 gram	90 ml
25 swabs	12,5 gram	112,5 ml
30 swabs	15 gram	135 ml
2 paar overschoentjes	10 gram	90 ml
25 gram dons	25 gram	225 ml
25 gram vlees	25 gram	225 ml
40 stukjes inlegvel	60 gram	540 ml

Ter uitvoering van Verordening (EG) nr. 2160/2003 is in de update van Verordening (EG) nr. 1003/2005 (gepubliceerd op 19-03-2009) aangegeven dat de monsters van vermeerderingskoppels van Gallus gallus als volgt behandeld dienen te worden:

Inlegvellen van uitkomstladen:

-
Plaats de inlegvellen in 1 liter BPw (kamertemperatuur) en schud voorzichtig. Volg verder de procedure vanaf 6.3.

Overschoentjes:

-
Pak het paar overschoentjes zorgvuldig uit om te vermijden dat aanhangend fecaal materiaal loskomt en plaats ze in 225 ml BPw (kamertemperatuur);
-
Bij samenvoegen van vijf paar overschoentjes tot twee monsters: breng vijf afzonderlijke monsters in minimaal 225 ml BPw en zorg ervoor dat alle monsters volledig ondergedompeld zijn;
-
Zwenk om, zodat het monster volledig verzadigd is, en volg verder de procedure vanaf 6.3.

Andere feces (mest) monsters:

-
Voeg de fecesmonsters samen en meng ze grondig. Neem een deelmonster van 25 g voor verdere kweek;
-
Plaats het deelmonster van 25 g in 225 ml BPw (kamertemperatuur). Volg verder de procedure vanaf 6.3.
-
Neem onmiddellijk na het mengen 50 g van het mengsel en voeg dat bij 200 ml BPw (kamertemperatuur). Volg verder de procedure vanaf 6.3.

6.3 Niet-selectieve ophoping

Incubeer de BPw 18 uur ± 2 uur bij 37 °C ± 1 °C.

In uitzonderlijke gevallen kan de BPw na incubatie maximaal 2 dagen bewaard worden bij 5 °C ± 3 °C.

6.4 Selectieve ophoping

Breng 0,1 mI BPw-cultuur op een MSRV plaat (9 cm) door 3 druppels, met een gezamenlijk volume van 0,1 ml, in een driehoek op de MSRV aan te brengen. Incubeer de platen 24 uur ± 3 uur bij 41,5 °C ± 1 °C. De platen moeten met het deksel van de Petrischaal naar boven geïncubeerd worden, aangezien het een half-vast medium is. Niet verdachte of negatieve platen dienen nogmaals 24 uur ± 3 uur bij 41,5 °C ± 1 °C bebroed te worden. Een verdachte MSRV-plaat vertoont groei in de agar (zwerming vanuit de entingsplaats) en heeft een wit/grijze kleur.

6.5 Uitplaten op selectief isolatiemedium

Verdachte MSRV platen worden afgeënt door aan de rand van de zwermzone met een (1 μl) öse materiaal uit de agar te nemen en daarmee een gedroogde XLD plaat te beënten. Incubeer de XLD platen gedurende 24 uur ± 3 uur bij 37 °C ± 1 °C.

De meeste Salmonella stammen zijn lactose-negatief en H₂S-positief en zijn op XLD te herkennen als roze kolonies met een zwart centrum (vaak helemaal zwart). Lactose-negatieve en H₂S-negatieve stammen vormen alleen roze kolonies (zonder zwarting). Beschouw daarom alle roze kolonies, met en zonder zwart centrum, als verdacht voor Salmonella. Er zijn ook lactosepositieve en H₂S-positieve Salmonella stammen die op XLD gele kolonies met een zwart centrum vormen en lactose-positieve en H₂S-negatieve stammen die helemaal geel zijn. Deze laatste twee groepen (met gele kolonies) komen bij pluimvee zelden voor.

6.6 Bevestiging

Voer de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 specifieke kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 specifieke kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur totdat een positief resultaat wordt verkregen. De kolonies worden vanaf de XLD plaat geënt in UA middels het afstrijken op het oppervlak van de agar en in TSI middels ladderen over het schuin gestolde oppervlak en een steekenting tot op de bodem van de buis. Beënt tevens een buis LDC door een hoeveelheid koloniemateriaal tegen de wand van de buis net onder het vloeistofoppervlak af te strijken. De buizen worden 24 uur ± 3 uur bij 37 °C ± 1 °C geïncubeerd.

Opmerking:

Wanneer geen goed losliggende kolonies op de XLD plaat zijn verkregen, of bij de aanwezigheid van veel spreidende of overgroeiende stoorflora, is het nodig ter zuivering een nieuwe reinstrijk op een gedroogde XLD- of nutriëntenagarplaat te maken. Bij verontreiniging van de Salmonella-kolonie met andere bacteriën wordt een afwijkend biochemisch patroon verkregen. Het is toegestaan om eerst de bevestigingstest met de TSI uit te voeren, en bij een verdachte uitslag door te gaan met ureum en LDC.

Na incubatie geven voor Salmonella verdachte kolonies de volgende biochemische resultaten:

TSI agar
onderin de buis	- geel - zwart - bellen/scheuren	- glucose positief (100%) - vorming van H₂S (91,6%) - gasvorming van glucose (91,9%)
schuine gedeelte	- rood/onveranderd	- lactose en/of sucrose negatief (resp. 99,2% en 99,5%)

Ureum agar
	- geen kleuromslag van het medium	- negatief (100%)

LDC
	- paarse kleur en groei in medium	- positief (94,6%)

Het gebruik van biochemische kits (zoals bijvoorbeeld API of BBL Crystal) is ook toegestaan.

Alle biochemisch verdachte kolonies dienen geserotypeerd te worden volgens het Kauffmann-White schema. Een toelichting op de serotypering van 6 veel voorkomende Salmonella serotypes is beschreven in PVE-SALMONELLA-SERO-291009.

7.. Controle

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:

-
Blanco controle,
-
Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),
-
Positieve controle.

De kwaliteitscontrole per batch MSRV is beschreven in paragraaf 3.

8. Opgave van het resultaat

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Geef het resultaat op als Salmonella aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht.

Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden (zie bijlage V) dan dient het laboratorium op het analysecertificaat hierover een opmerking te maken en de eventuele gevolgen voor de betrouwbaarheid van de uitslag aan te geven.

9. ISO 6579 Annex D

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Geprobeerd is de PVE branchemethode MSRV zoveel mogelijk gelijk te maken aan Annex D van ISO 6579. Echter op een tweetal aspecten verschilt de PVE branchemethode nog met Annex D:

-
Annex D schrijft voor dat het uitplaten vanaf MSRV dient te geschieden op XLD en op een tweede selectieve agarplaat naar keuze. In de PVE branchemethode is alleen XLD als uitplaatmedium aangegeven. Dit is in lijn met de vorige versie(s) van de PVE branchemethode MSRV waarin ook slechts één uitplaatmedium werd voorgeschreven, zijnde BGA. Uit literatuur blijkt dat XLD een hoge sensitiviteit en specificiteit heeft (Cooke et al., 1999) en in sommige pluimveemonsters een hoger percentage positiviteit vertoont dan BGA (Rall et al., 2005). De belangrijkste Salmonella serotypes die bij pluimvee worden gevonden groeien op XLD (Feldsine et al., 2003), zodat verwacht mag worden dat een tweede uitplaatmedium naast XLD weinig extra informatie toevoegt.
-
De biochemische bevestiging zoals beschreven in Annex D is uitgebreider dan die van de PVE branchemethode. Echter, de in de PVE branchemethode beschreven bevestigings testen zijn reeds voldoende om de meerderheid van de Salmonella verdachte kolonies op XLD als biochemisch verdacht te kenmerken. Na de biochemische bevestiging vindt ook nog een serotypering plaats wat uiteindelijk de definitieve uitslag voor Salmonella geeft.

10. Bronvermelding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Cooke, V.M., R.J. Miles, R.G. Price and A.C. Richardson, 1999. A novel chromogenic ester agar medium for detection of Salmonellae. Applied and Environmental Microbiology, 1999, Vol. 65, no 2, p 807-812.
Feldsine, P.T., Lienau, A.H., Leung, S.C., Mui, L.A., Humbert, F., Bohnert, M., Mooijman, K., Schulten, S, in t Veld, P., Rollier, P., Leuschner, R and Capps, K., 2003. Detection of Salmonella in fresh cheese, poultry products, and dried egg products by the ISO 6579 Salmonella culture procedure and the AOAC official method: Collaborative study. Journal of AOAC International, vol 86, no. 2, 2003, 275-295.
Hartman, dr. E.G., 1999. Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)- medium. Gezondheidsdienst voor dieren, GD projectnummer 401909, rapport nr. 1, september 1999.
ISO 6579:2002 / Amendment 1:2007. Annex D: Detection of Salmonella spp. in animal faeces and in environmental samples from the primary production stage. International Standardisation Organisation, Geneva, Switzerland.
PVE-SALMONELLA-SERO-291009. Toelichting op de serotypering van Salmonella volgens het White-Kauffmann-Le Minor schema. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl
NEN-EN-ISO 6579:2002. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders Horizontale methode voor het aantonen van Salmonella spp. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.
NEN-EN-ISO 7218:2007 En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.
Rall, V.L.M., R. Rall, L. Casale Aragon and M. Guimaraes da Silva, 2005. Evaluation of three enrichment broths and five plating media for Salmonella detection in poultry. Brazilian Journal of Microbiology, 2005, 36: 147-150.
Verordening (EG) nr. 1003/2005 ter uitvoering van Verordening (EG) nr. 2160/2003 van het Europees Parlement en de Raad wat betreft een communautaire doelstelling voor het verminderen van de prevalentie van bepaalde serotypen Salmonella bij vermeerderingskoppels van Gallus gallus en tot wijziging van Verordening (EG) nr. 2160/2003. Publicatieblad van de Europese Unie, L 170/12, 01072005.
Zee, van der H., E. De Boer, P. Van Netten, 1990. Salmonella isolatie met behulp van MSRV. De Ware (n) chemicus 20: 189-199.

Paragraaf 2. PVE-SALMONELLA-MSRV-291009: Samenstelling en bereiding van media en reagentia

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

1. Gebufferd pepton water (BPw)

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Samenstelling:

Pepton	10,0 g
NaCI	5,0 g
Na₂HP0₄.12H₂0	9,0 g
KH₂P0₄	1,5 g
Water	1000 ml

Bereiding:

-
Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting);
-
Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,0 ± 0,2 bij 25°C bedraagt;
-
Verdeel het medium over daarvoor geschikte flessen of potten;
-
Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121°C).

2. Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium (MSRV)

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Oplossing A (basis):

Tryptose	4,6 g
Caseine hydrolysaat	4,6 g
NaCI	7,3 g
KH₂P0₄	1,5 g
MgCl₂	10,9 g
Malachietgroen oxalaat	0,04 g
Agar	2,7 g
Water	1000 ml

Bereiding

-
Los de ingrediënten op in het water;
-
Breng het mengsel onder voortdurend mengen aan de kook (verhit niet te lang!);
-
NIET AUTOCLAVEREN;
-
Indien nodig, stel de pH, zodat deze na verhitten 5,2 (5,1 - 5,4) bij 25 °C bedraagt;
-
Koel het mengsel af tot 47 – 50 °C.

Oplossing B (novobiocine):

-
Los 0,05 g novobiocine op in 10 ml water;
-
Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie (filter met poriegrootte van 0,22 µm).
-
Indien de oplossing niet direct wordt gebruikt kan deze opgeslagen worden bij 5 °C ± 3 °C voor maximaal 4 weken, of bij -20 °C ± 5 °C voor maximaal 1 jaar.

Bereiding MSRV medium:

-
Voeg 2 ml van oplossing B aseptisch toe aan oplossing A (1000 ml), bij 47 – 50 °C;
-
Meng de oplossing voorzichtig;
-
De eind pH dient 5,2 (5,1 5,4) bij 20-25 °C te zijn;
-
Giet uit in Petrischalen (15-20 ml in Petrischalen met een diameter van 9 cm);
-
Laat het medium stollen en behandel de platen voorzichtig;
-
Bewaar de platen, rechtop, bij 5 °C ± 3 °C (in het donker) voor maximaal 2 weken;
-
Keer de platen niet om, de agar is hiervoor te slap;
-
Indien nodig, droog de platen vlak voor gebruik, bijvoorbeeld door ze rechtop zonder deksel in een Laminar Air Flow kabinet te plaatsen.

3. Xylose Lysine Desoxycholaat (XLD) agar

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Samenstelling

Gistextract	3,0 g
NaCl	5,0 g
Xylose	3,75 g
Lactose	7,5 g
Sucrose	7,5 g
L-lysinehydrochloride	5,0 g
Natriumthiosulfaat	6,8 g
IJzer(III)ammoniumcitraat	0,8 g
Fenolrood	0,08 g
Natriumdesoxycholaat	1,0 g
Agar	9 g tot 18 g (afhankelijk van de gelsterkte)
Water	1000 ml

Bereiding:

-
Los de ingrediënten op in het water en breng het mengsel onder voortdurend mengen aan de kook en verhit tot de agar is opgelost (verhit niet te lang!);
-
NIET AUTOCLAVEREN;
-
Indien nodig, stel de pH, zodat deze na verhitten 7,4 ± 0,2 bij 25 °C bedraagt;
-
Koel het mengsel af tot 47-50 °C en giet vervolgens uit in Petrischalen (15-20 ml in Petrischalen met een diameter van 9 cm);
-
Laat het medium stollen;
-
Bewaar de platen bij 5 °C ± 3 °C voor maximaal 5 dagen;
-
Indien nodig, droog de platen voor gebruik.

4. Ureumagar (UA)

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Oplossing A (basismedium):

Pepton	1,0 g
Glucose	1,0 g
NaCI	5,0 g
KH₂P0₄	2,0 g
Fenolrood	12,0 mg
Agar	9,0 tot 18,0 g (afhankelijk van de gelsterkte)
Water	1000 mI

Bereiding:

-
Los de ingrediënten op in het water (indien nodig middels verhitten);
-
Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 6,8 ± 0,2 bij 25 °C bedraagt;
-
Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 121 °C in een autoclaaf;
-
Laat de oplossing afkoelen tot 47-50 °C.

Oplossing B (ureumoplossing):

Ureum	400 g
Water	1000 ml

Bereiding:

-
Los de ureum op in het water;
-
Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie (filter met poriegrootte van 0,22 µm).

Samenstelling compleet medium:

oplossing A	950 ml
oplossing B	50 ml

Bereiding:

-
Voeg oplossing B (ureumoplossing) aseptisch toe aan oplossing A (basismedium), bij 47-50 °C;
-
Verdeel het medium over steriele buizen, per buis 10 ml medium;
-
Laat de buizen stollen zodat een schuin gedeelte ontstaat.

5. Triple-sugar-ironagar (TSI)

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Samenstelling:

VIeesextract	3,0 g
Gistextract	3,0 g
Pepton	20,0 g
NaCI	5,0 g
Lactose	10,0 g
Sucrose	10,0 g
Glucose	1,0 g
IJzer (III) citraat	0,3 g
Natriumthiosulfaat	0,3 g
FenoIrood	0,024 g
Agar	9,0 tot 18,0 g (afhankelijk van de gelsterkte)
Water	1000 mI

Bereiding:

-
Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting);
-
Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 bij 25 °C bedraagt;
-
Verdeel het medium over buizen, per buis 10 ml medium;
-
Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 121°C in een autoclaaf;
-
Laat de buizen stollen zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, een schuin gedeelte ontstaat.

6. L-Lysine-decarboxylase medium (LDC)

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Samenstelling:

1-Lysine monohydrochloride	5,0 g
Gistextract	3,0 g
Glucose	1,0 g
Bromocresol purper	0,015 g
Water	1000 ml

Bereiding:

-
Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting);
-
Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 6,8 ± 0,2 bij 25 °C bedraagt;
-
Verdeel het medium over smalle reageerbuizen; per buis 5 mI medium;
-
Steriliseer gedurende 15 min bij 121°C in een autoclaaf.

Paragraaf 3. PVE-SALMONELLA-MSRV-291009: Kwaliteitscontrole van batches MSRV

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Onderwerp

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Deze paragraaf beschrijft een methode voor de kwaliteitscontrole van batches MSRV.

Werkwijze

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Volg onderstaand schema voor de kwaliteitscontrole per batch MSRV.

Positieve controle

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Inoculum:	Kolonie aanstippen met een entoogje en afstrijken langs de wand van een buisje met (10 ml) gebufferd peptonwater (BPw). Incubeer 18 uur ± 2 uur bij 37 °C ± 1 °C. De cultuur zal in BPw uitgroeien tot circa 10⁸ cfu/ml. Maak verdunningen in BPw tot circa 10³ cfu/ml.
Controlestam:

Negatieve controle

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Als negatieve controle kan een Escherichia coli stam gebruikt worden.

Kweek de stam op zoals beschreven voor de positieve controle. Maak verdunningen in BPw tot 10⁵ – 10⁶ cfu/ml.

Volg de procedure zoals beschreven voor de positieve controle.

E. coli dient geen zwerming te vertonen op MSRV.

Opmerking:

Controlestammen zijn onder andere verkrijgbaar bij de VWA in Groningen (www.vwa.nl/chek).

Hoofdstuk 4. PVE-SALMONELLA-SERO-291009

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Paragraaf 1. Toelichting op de serotypering van Salmonella volgens het White-Kauffmann-Le Minor schema

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

1. Inleiding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Voor de serotypering van Salmonella spp. volgens het White-Kauffmann-Le Minor schema (Grimont en Weil, 2007) worden door diverse fabrikanten verschillende voorschriften geleverd. Voor de juiste wijze van typeren dient dan ook altijd het voorschrift van de fabrikant gevolgd te worden.

Details over de taxonomie van Salmonella alsmede over de antigene formules van de Salmonella serotypen staan beschreven in Grimont en Weil (2007), welke gepubliceerd is op de volgende website:

www.pasteur.fr

Onderstaande informatie is een korte toelichting hierop.

De serotypering van Salmonella spp. bestaat uit de volgende stappen:

-
Selectie van een Salmonella verdachte kolonie (vastgesteld middels biochemische typering);
-
Onderzoek naar auto-agglutinatie;
-
Agglutinatie met O-antisera: voor het aantonen van O-antigenen in het Lipopolysaccharide (LPS) van de bacterie;
-
Agglutinatie met H-antisera: voor het aantonen van de H-antigenen in de flagellen van de bacterie.

In het onderstaande stuk wordt de procedure beschreven voor het serotyperen van 6 Salmonella serotypen welke regelmatig bij pluimvee worden aangetroffen (zie ook paragraaf 2). Deze 6 Salmonella serotypen betreffen:

Salmonella Typhimurium (1, 4, [5], 12 : i : 1, 2)

Salmonella Paratyphi B var. Java (1, 4, [5], 12 : b : 1, 2)

Salmonella Enteritidis (1, 9, 12 : g, m : -)

Salmonella Infantis (6, 7, 14 : r : 1, 5)

Salmonella Virchow (6, 7, 14 : r : 1, 2)

Salmonella Hadar (6, 8 : z₁₀ : e, n, x)

2. Selectie van een Salmonella verdachte kolonie

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Kweek een reincultuur van een kolonie welke middels biochemische typering als verdacht voor Salmonella kan worden beschouwd. Gebruik de kweekmethode en het medium zoals voorgeschreven door de fabrikant.

3. Onderzoek naar auto-agglutinatie

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Voer het onderzoek naar auto-agglutinatie uit volgens het voorschrift van de fabrikant. De wijze van onderzoek naar auto-agglutinatie alsmede het aflezen geschiedt op gelijke wijze als de agglutinatie met O-antisera (zie ook 4. Agglutinatie met O-antisera).

Een voorbeeld voor onderzoek naar auto-agglutinatie is hieronder beschreven.

Breng op een objectglas een druppel zoutoplossing (0,85% NaCl);

Breng met een steriele entnaald bacteriemateriaal in de druppel zodat een lichte melkachtige suspensie wordt verkregen;

Beweeg het objectglas heen-en-weer (druppel laten zwenken). De tijd van zwenken varieert per fabrikant van 5 sec tot 60 sec;

Beoordeel de suspensie. De aanwezigheid van klontjes in het preparaat duidt op autoagglutinatie van de onderzochte stam. De stammen die auto-agglutinatie vertonen kunnen niet verder onderzocht worden voor serotypering.

Controleer voor gebruik of de antisera (O en H) helder zijn. Indien troebeling zichtbaar is volg dan de aanwijzingen van de fabrikant.

Opmerking: Bewaar goed getypeerde Salmonella stammen van ringonderzoeken om antisera te testen.

4. Agglutinatie met O-antisera (of monoclonale antilichamen)

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Voor het aantonen van de 6 bovengenoemde Salmonella serotypen worden de volgende O-antisera gebruikt (in volgorde van de hierboven genoemde serotypen):

Begin de agglutinatie met O:4 antiserum. Levert dit een negatief resultaat op, test dan met O:9 antiserum. Levert dit ook een negatief resultaat op test dan met O:7 antiserum. Levert dit ook een negatief resultaat op test dan met O:8 antiserum.

Volg voor de uitvoering en het aflezen van de agglutinatiereactie strikt het voorschrift van de fabrikant.

Een aantal fabrikanten gebruikt een objectglas methode voor het agglutineren. Daarbij wordt een druppel antiserum gemengd met bacteriemateriaal (direct vanaf plaat of vanuit een bacteriesuspensie) op het objectglas, zodanig dat een lichte melkachtige suspensie wordt verkregen. Het objectglas wordt vervolgens heen-en-weer bewogen (druppel laten zwenken).

Vervolgens wordt de reactie afgelezen. De aanwezigheid van klontjes in het preparaat duidt op een positieve reactie. Per fabrikant kunnen o.a. de volgende zaken verschillen:

5. Grootte van de druppel op het objectglas (bijv. ‘25 μl’ of ‘een druppel’);
6. Wijze van opbrengen van antiserum en bacteriemateriaal op het objectglas (bacteriemateriaal direct vanaf agar of via een suspensie toevoegen aan een druppel antiserum op het objectglas of antiserum toevoegen aan een druppel ‘bacteriesuspensie’ op het objectglas);
7. Zwenktijd van het objectglas (kan variëren van 5 sec tot 60 sec);
8. Wijze van aflezen van het resultaat (met blote oog, met vergrootglas, tegen een donkere achtergrond, etc.);
9. Interpretatie van de resultaten (lees met name de voetnoten m.b.t. de beperkingen).

5. Agglutinatie met H-antisera (of monoclonale antilichamen)

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Na het agglutineren met O-antisera, vindt de agglutinatie met H-antisera plaats. Salmonella bezit vaak twee typen H-antigeen (fase 1 en fase 2). Indien bij difasische stammen één H-fase negatief wordt gevonden, dient de tweede fase aangetoond te worden middels een fase-inversie methode. Bij fase-inversie wordt het dominante H-antigeen onderdrukt zodat het 2^e H-antigeen tot expressie kan komen en kan worden aangetoond. Het medium dat hiervoor gebruikt wordt dient zodanig te zijn dat Salmonella hier goed in kan bewegen. Een voorbeeld van een dergelijk ‘zwerm medium’ is Sven Gard agar. Een voorbeeld van een fase inversie methode wordt onder 6. beschreven.

Volg voor zowel het opkweken van de stam als voor het uitvoeren en het aflezen van de agglutinatiereactie met H-antiserum de voorschriften van de fabrikant.

Gebruik de volgende H-antisera voor het aantonen van de 6 hierboven genoemde Salmonella serotypes.

O:4 positief

Agglutineer met H:i én H:2 antisera. Indien beiden een positief resultaat opleveren dan is de uitslag: Salmonella Typhimurium.

Voor Salmonella Paratyphi B var. Java dient de agglutinatie met H:b én H:2 antisera positief te zijn.

O:9 positief

Test met H:G(complex) antiserum. Indien dit een positief resultaat oplevert, test dan vervolgens met H:m antiserum. Indien dit ook een positief resultaat oplevert voer dan een negatieve controle uit op H:q, H:s en H:t antisera. Indien het resultaat als volgt is:

H:G : +, H:m : + , H:q : -, H:s : - en H:t : -, test dan met O:46 of met O:12 (O:2,12 of O:4,12). Indien vervolgens de agglutinatie met O:46 negatief is, of de agglutinatie met O:12 positief is, dan is de uitslag: Salmonella Enteritidis.

N.b.: Let op bij de aanschaf van H:G(complex) antiserum dat onderscheid gemaakt kan worden tussen H:g,m en H:m,t. Bijvoorbeeld: met H:g,p antiserum kan onderscheid gemaakt worden tussen H:g,m en H:m,t. Echter met een H:g,m antiserum kan dit onderscheid niet gemaakt worden. Bovendien kan met een H:g,m antiserum geen H:g aangetoond worden bij H:g,m stammen. Dit kan wel met H:g,p antiserum.

O:7 positief

Agglutineer met H:r én H:2 én H:5 antisera.

Indien H:r én H:5 positief zijn dan is de uitslag: Salmonella Infantis.

Indien H:r én H:2 positief zijn dan is de uitslag: Salmonella Virchow.

O:8 positief

Agglutineer met H:z₁₀ én H:x antisera. Indien beiden positief zijn agglutineer dan vervolgens met O:6,7 of met O:6₁ antiserum. Indien ook O:6,7 of O:6₁ een positief resultaat oplevert dan is de uitslag: Salmonella Hadar.

N.b.: Let op bij de aanschaf van O:6,7 antiserum dat dit antiserum ook goed reageert met O:6,8 stammen (informeer bij de fabrikant).

6. Voorbeeld fase inversie met Sven Gard methode

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Het hieronder beschreven voorbeeld voor een fase inversie methode betreft de serotypering van Salmonella Typhimurium. In zijn algemeenheid is de methode ook toepasbaar voor andere Salmonella serotypes.

Indien O:4 en H:i positief zijn en H:2 negatief, handel dan als volgt:

Bereid een agarplaat met anti-H:i (bijvoorbeeld Sven Gard serum-mix welke H:i bevat). Ent de stam op het centrum van deze plaat (volg voorschrift van de fabrikant). Agglutineer na incubatie met H:2. Indien dit opnieuw een negatief resultaat oplevert, agglutineer dan opnieuw met H:i. Indien H:i een negatieve of zwakke agglutinatie vertoont dan is het resultaat geen Salmonella Typhimurium. Indien H:i wel een positieve (sterke) agglutinatie vertoont voer dan een tweede fase inversie uit. Bereid hiertoe opnieuw een agarplaat met anti-H:i. Neem bacteriemateriaal van de buitenrand van de eerste fase inversie plaat voor het beënten van de tweede fase inversie plaat. Herhaal de procedure zoals hierboven beschreven.

7. Bronvermelding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Grimont, P.A.D. and Weil, F-X., 2007. Antigenic formulas of the Salmonella serovars. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Institute Pasteur, Paris, France.

http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/salmoms/WKLM_2007.pdf

Paragraaf 2. PVE-SALMONELLA-SERO-291009: Schema voor het serotyperen van 6 Salmonella serotypen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Hoofdstuk 5. PVE-SALMONELLA-VIDAS-140607

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van VIDAS SLM in dons, afkomstig van pluimvee

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

1. Onderwerp

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Dit protocol beschrijft een 48-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de VIDAS SLM test (bioMérieux) in dons afkomstig van pluimvee.

2. Definities

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Salmonella: alle typen Salmonella waarvan zowel O als H antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.

3. Principe

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

VIDAS SLM is een enzym immunoassay voor detectie van Salmonella antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en geautomatiseerd uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat.

De voorophoping en de selectieve ophopingen vinden achtereenvolgens plaats gedurende 18 uur in een voorophopingsmedium, 6-8 uur in 2 verschillende selectieve ophopingsmedia en als laatste gedurende 18 uur in een 3^e ophopingsmedium. Van dit laatste ophopingsmedium wordt een hoeveelheid verhit en in een reagens strip gebracht. De reagens strip wordt in het VIDAS analyse apparaat gebracht, waarna het aantonen van aanwezigheid van Salmonella antigenen met behulp van een cocktail van specifieke monoclonale antilichamen en een fluorescentie reactie volledig geautomatiseerd verloopt. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 45 minuten beschikbaar.

4. Reagentia en andere materialen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn.

De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage IV, hoofdstuk 3, paragraaf 2. Er mag echter ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn.

De VIDAS SLM test bestaat uit kant-en-klare reagentia, zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM 30 702 test, instructie van de fabrikant.

Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218:2007

4.1 Niet-selectief voorophopingsmedium
gebufferd pepton water	BPw
bijvoorbeeld bioMérieux ref. 42043

4.2 Selectieve ophopingsmedia
Muller-Kaufmann tetrathionate broth met novobiocine	MKTTn
bijvoorbeeld bioMérieux ref. 42114

Rappaport-Vassiliadis Soya bouillon	RVS
bijvoorbeeld bioMérieux ref. 42110

M bouillon	Mb
bioMérieux ref. 42077

4.3 Selectieve agar
Xylose Lysine Desoxycholaat agar	XLD
bijvoorbeeld bioMérieux ref. 43563

5. Apparatuur en glaswerk

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de VIDAS SLM test benodigde apparatuur, zoals onderstaand vermeld:

5.11 Broedstoof voor het bebroeden bij 37°C ± 1°C
5.12 Broedstoof voor het bebroeden bij 41,5°C ± 1°C
5.13 Micropipet (500 μl)
5.14 Steriele micropipetpunten
5.15 Waterbad (95-100 °C) of equivalent
5.16 Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm
5.17 Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml
5.18 Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm
5.19 Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm
5.20 Stomacherzakken (met filter)
5.21 VIDAS analyse apparaat

Opmerking:

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

6. Werkwijze

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

6.1 Algemeen

Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V.

De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur na monstername op het laboratorium aanwezig zijn, dient het monster uiterlijk 48 uur + 4 uur na het tijdstip van monstername ingezet te worden.

6.2 Voorophoping

Verdun het monster 1:10 in BPw (25 gram dons in 225 ml BPw).

Stomacher, en incubeer de BPw 18 uur ± 2 uur bij 37°C ± 1°C.

6.3 Selectieve ophoping

Breng na incubatie van de BPw 1 ml van deze suspensie over in 10 ml MKTTn bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 37°C ± 1°C.

Breng tegelijkertijd ook 0,1 ml van deze BPw suspensie over in 10 ml RVS bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 41,5°C ± 1°C.

6.4 Na-ophoping

Breng na incubatie van de MKTTn bouillon 0,1 ml hiervan over in 10 ml M bouillon. Breng na incubatie van de RVS bouillon 1 ml hiervan over in een 2e buis met 10 ml M bouillon. Herincubeer de MKTTn bouillon en de RVS bouillon voor nog eens 16-20 uur, om bevestiging achteraf mogelijk te maken.

Incubeer de M bouillon buizen gedurende 16-20 uur bij 41,5°C ± 1°C.

Meng de M bouillon buizen na incubatie en breng uit elke buis 1 ml over in 1 gezamenlijk eppendorfbuisje. Sluit het buisje en verhit gedurende 15 ± 1 minuten in een waterbad van 95- 100°C. Voer vervolgens de VIDAS SLM test uit volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.

Bewaar de overgebleven bouillons bij 2-8°C voor eventuele bevestiging.

6.5 Beoordeling

Resultaten worden beoordeeld zoals omschreven in het voorschrift van de fabrikant (gebruiksaanwijzing VIDAS SLM 30 702 test). Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar de zgn. Test Value. Resultaten met een Test Value onder de 0,23 betreffen monsters waarin Salmonella antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten met een test Value >/= 0,23 worden als Salmonella-positief gerapporteerd. Positieve resultaten moeten worden bevestigd met behulp van de bewaarde ophopings- en naophopingsmedia.

6.6 Bevestiging van positieve resultaten

Ent met een öse vanuit de ophopingsbouillons (MKTTn en RVS) en vanuit de koel bewaarde M bouillons af op gedroogde XLD platen. Incubeer deze platen gedurende 24 uur ± 3 uur bij 37°C ± 1°C.

6.7 Beoordeling XLD platen

Er zijn ook lactose-positieve en H₂S-positieve Salmonella stammen die op XLD gele kolonies met een zwart centrum vormen en lactose-positieve en H2S-negatieve stammen die helemaal geel zijn. Deze laatste twee groepen (met gele kolonies) komen bij pluimvee zelden voor.

Bevestiging van verdachte kolonies, zowel biochemisch als serologisch, vindt vervolgens plaats zoals omschreven in PVE-SALMONELLA-MSRV-291009 en PVE-SALMONELLA-SERO- 291009.

7. Controle

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

De VIDAS SLM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, instructie van de fabrikant.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:

-
Blanco controle,
-
Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),
-
Positieve controle.

8. Opgave van het resultaat

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

9. Bronvermelding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Gebruiksaanwijzing VIDAS SLM 30 702 test, instructie van de fabrikant.
Hartman, E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr. 401919, september 1999.
NEN-EN-ISO 6579:2002. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Horizontale methode voor het aantonen van Salmonella spp. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.
NEN-EN-ISO 7218:2007 En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.
PVE-SALMONELLA-MSRV-291009 . PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van MSRV in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee. Productschap Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl
PVE-SALMONELLA-SERO-291009. Toelichting op de serotypering van Salmonella volgens het Kauffmann-White schema. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl
Van der Zee, H. et al. Validatierapport van de Salmonella bepaling in de matrix dons met behulp van de VIDAS SLM methode. PVE, september 2002.

Hoofdstuk 6. PVE-SALMONELLA-IQ-II-291009

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Paragraaf 1. PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van iQ-Check^TM Salmonella II real-time PCR in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee.

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

1. Onderwerp

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Dit protocol beschrijft een 24-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de iQ-Check^TM Salmonella II kit (Bio-Rad Laboratories b.v.) in dons, mest en vlees afkomstig van pluimvee.

2. Definitie

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Salmonella: alle typen Salmonella waarvan het DNA aan de hand van de Polymerase Chain Reactie (PCR) wordt aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.

3. Principe

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Uit een voorophopingsmedium wordt, na voorincubatie, het DNA van Salmonella geïsoleerd. Met behulp van de real-time polymerase chain reaction (PCR) worden Salmonella-specifieke DNA sequenties gelijktijdig vermenigvuldigd en gedetecteerd middels fluorescente probes. Inclusief voorophoping wordt een positieve of negatieve uitslag verkregen binnen 24 uur.

4. Reagentia en andere materialen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in paragraaf 2. Er mag echter ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn. De iQ-Check^TM Salmonella II kit bestaat uit kant-en-klare reagentia.

Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn.

Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218:2007.

4.1 Niet-selectief voorophopingsmedium
gebufferd pepton water (BPw)	paragraaf 2.1

4.2 iQ-Check^TM Salmonella II kit	Bio-Rad code 357-8123, paragraaf 2.2

5. Apparatuur en verbruiksmaterialen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

De gebruikelijke apparatuur voor een moleculair/microbiologisch laboratorium en de voor de iQ-Check^TM Salmonella II test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld:

Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

Apparatuur

5.1 iCycler Thermal Cycler met 96-wells reactiemodule (Bio-Rad cat. #: 170-8720)
5.2 iCycler iQ Optical Module (Bio-Rad cat. #: 170-8740)
5.3 iCycler iQ5 Real Time PCR system (Bio-Rad cat. #: 359-1591)
5.4 Chromo4 Real Time PCR system (Bio-Rad cat. #: 359-1590G)
5.5 Mini-Opticon Real Time PCR system(Bio-Rad cat. #: 359-1592)
5.6 CFX96 Real Time PCR system (Bio-Rad cat. #: 351 855096)
5.7 Stomacher
5.8 Broedstoof voor het bebroeden bij 37 °C ± 1°C
5.9 Verhittingsblok voor 1,5 ml buizen 100 °C ± 1°C
5.10 Tafelcentrifuge (maximaal 12.000 rpm, voor 1,5 ml buizen)
5.11 Vortex
5.12 Magnetische roerder
5.13 20 μl, 200 μl and 1000 μl micropipetten
5.14 Combi-tips pipetten

Opmerking: Het gebruik van een universal power source (UPS) in combinatie met de iCycler iQTM wordt aanbevolen. Inmiddels (anno 2009) is de iCycler iQ niet meer leverbaar en de iQ5 alleen nog beperkt als refurbished (2^e hands) te verkrijgen. De gebruiker heeft een keuze uit 5 systemen (iCycler iQ, iQ5, Chromo4, Mini-Opticon en CFX-96).

Verbruiksmaterialen

5.15 iCycler iQ 96-well PCR platen (Bio-Rad cat. #: 223-9441)
5.16 iCycler iQ Optical sealing tape (Bio-Rad cat. #: 223-9444)
5.17 200 μl 8-strip tubes (Bio-Rad cat. #: 223-9469)
5.15 200 μl 8-strip caps for 200 μl tubes (Bio-Rad cat. #: 223-9472)
5.16 Multiplate PCR plates, white (Bio-Rad cat. #:35M-LL4851), 48wells
5.17 Multiplate PCR plates, white (Bio-Rad cat. #:35M-LL9651), 96wells
5.18 8-strip tubes, white (Bio-Rad cat. #:35T-LS0851)
5.19 8-strip caps, (Bio-Rad cat. #:35T-CS0803)
5.20 MSB sealing tape (Bio-Rad cat. #:35M-SB1001)
5.21 Stomacher zakken met filter
5.22 1 ml en 10 ml pipetten
5.23 Steriele filtertips, passend op 20 μl, 200 μl en 1000 μl micropipetten
5.24 1,5 ml Eppendorf SafeLock buisjes
5.25 Combi-tips tips, steriel, individueel verpakt
5.26 2 ml and 5 ml steriele buizen of flesjes
5.27 Poeder-vrije handschoenen
5.28 Milli-Q of gedestilleerd steriel water
5.29 Ethanol 96% of NaOH 5%

Opmerking:

Artikelen genoemd onder 5.16-5.18 betreffen artikelen voor Chromo4, Mini-Opticon en CFX

6. Voorzorgsmaatregelen en aanbevelingen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

De test dient te worden uitgevoerd door getraind personeel.

De test dient te worden uitgevoerd door getraind personeel. Monsters en kweken dienen te worden behandeld en afgevoerd als potentieel infectieus materiaal.

De kwaliteit van de resultaten is afhankelijk van een strikte uitvoering conform Good Laboratory Practice, in het bijzonder aangaande PCR:

Gebruik specifieke, gescheiden sets laboratorium benodigdheden zoals pipetten en buizen voor bijvoorbeeld DNA extractie en de bereiding van PCR mix.
Het is van groot belang dat gebruik wordt gemaakt van een positieve en negatieve controle in elke serie van amplificatie reacties (´PCR run´).
Gebruik geen reagentia waarvan de houdbaarheidsdatum is verstreken.
Homogeniseer reagentia voorafgaand aan gebruik.
Controleer regelmatig de nauwkeurigheid en precisie van alle pipetten en apparatuur.
Verwissel handschoenen met enige regelmaat, vooral indien contaminatie wordt verondersteld.
Voer periodieke reiniging uit van de werkplaats met tenminste 5% bleekmiddel.
Vermijdt gebruik van latex handschoenen met poeder. Voorkom vingerafdrukken op het optisch sealing tape.
Schrijf niet op de caps van PCR-tubes of op de sealtap, danwel tubes. In beide gevallen zal de real-time data-acquisitie hinder ondervinden. Aan de zijkanten van de strips zitten randen of lipjes waarop een ID genoteerd kan worden. Strips zijn gemerkt met letters A en H aan de uiteinden.

7. Werkwijze

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

7.1 Algemeen

Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-8°C) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V.

Stel monsters zo min mogelijk bloot aan temperatuurschommelingen.

Opmerking:

Komen mestmonsters mee met vleesmonsters in een koelbox, sla dan alle monsters gekoeld op.

Worden mestmonsters per post ongekoeld verstuurd, sla dan op bij kamertemperatuur, tenzij deze monsters pas de volgende dag worden ingezet.

7.2 Voorbehandeling van het monster en ophoping

Ophopingsmedium dient op incubatie temperatuur (37°C) te zijn voorafgaand aan gebruik.

Homogenizeer 25 g monster in 225 ml gebufferd pepton water, in een stomacher zak met filter.

Incubeer zonder schudden gedurende 18 uur ± 2 uur bij 37°C.

Opmerking: Bij verwerking van borstvel ten behoeve van de verdunning dient zo min mogelijk onderhuids vet meegesneden te worden; een overmaat vet kan de isolatie van DNA bemoeilijken en inhibitie van de PCR-reactie veroorzaken. Mest en dons vergen geen bijzondere voorbehandeling.

7.3 DNA extractie

Pipetteer 1 ml ophoping met een disposable pipet in een 1,5 ml Eppendorf (schroefdopje) buis (voorkom pipetteren van grote fragmenten van monsterresten). Schudt de ophoping niet voorafgaand aan het pipetteren van het monster.

De overige stappen voor de DNA extractie worden uitgevoerd zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de iQ-Check^TM Salmonella II testkit (Bio-Rad, 2007).

Opmerking: In geval van ophopingen met een vettig supernatant, neem het monster juist onder deze vetlaag.

7.4 Apparaat en software gebruik, uitvoering PCR, data analyse

Apparatuur en software gebruik, uitvoering PCR en data analyse worden allen uitgevoerd zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de iQ-Check^TM Salmonella IItestkit (Bio-Rad, 2007).

7.5 Interpretatie van resultaten

Resultaten worden geïnterpreteerd middels analyse van de Ct-waarden (threshold cycle) van elk monster. Volg hiervoor het voorschrift van de fabrikant.

Een positief Salmonella monster dient een Ct-waarde >/= 10 voor de FAM fluorophore te hebben.

Indien de Ct-waarde lager dan 10 is, dient het verloop van de amplificatiecurve gecontroleerd te worden zoals beschreven in gebruiksaanwijzing; de curve dient een vlakke basislijn te vertonen, gevolgd door een geleidelijke toename van fluorescentie. Indien de curve correct is, kan het monster positief voor Salmonella worden bevonden.

Indien geen Ct-waarde (Ct=N/A, not applicable ) voor FAM is toegekend aan een monster, of de curve een niet-kenmerkend verloop vertoont, moet de interne controle van dat monster worden geanalyseerd. Wanneer geen Ct-waarde (Ct=N/A) wordt verkregen voor FAM, dan is de uiteindelijke interpretatie van het resultaat afhankelijk van de interne controle:

-
Een monster wordt negatief beschouwd voor Salmonella indien geen Ct-waarde voor FAM is toegekend, en de interne controle (HEX) een Ct-waarde > 10 heeft.
-
Indien de interne controle ook geen Ct-waarde is toegekend (Ct = N/A), dan is interpretatie van het resultaat onmogelijk. Een dergelijk resultaat kan een indicatie zijn van remming van de PCR reactie. In dit geval dient het monster (DNA-extract) 1/10 verdund te worden in steriel gedestilleerd water en moet de PCR reactie worden herhaald. Verdunningsprotocol gaat als volgt: 90 μl steriel water met 10 μl DNA. Hiervan wordt namengen en kort centrifugeren (short spin) 5 μl toegevoegd aan de PCRmix.

Interpretatie van monsterresultaten:

Salmonella detectie	Interne controle detectie	Resultaat
(FAM-490)	(HEX)
Ct >/ = 10	Niet van belang	Positief
Ct = N/A	Ct > 10	Negatief
Ct = N/A	Ct = N/A	Inhibitie*

* Wanneer zowel Salmonella als interne controle detectie een Ct = N/A oplevert, dient het monster opnieuw getest te worden middels een 1/10 verdunning van het DNA-extract.

Opmerking:

Bio-Rad heeft inmiddels software ter beschikking gesteld waarin de FAM en HEX waarden via “Copy-Paste” ingevuld kunnen worden. Er volgen automatisch antwoorden per monster als: positief, negatief en inhibitie. Tevens worden automatisch de waarden van de kitcontroles gevalideerd. Dit rapport kan in een PDF file geconverteerd worden. De software heet : iQCheck Analysis TM. Bovendien hebben de Chromo4 en Mini-Opticon systemen deze software al aan boord, zodat direct een rapport kan worden aangemaakt.

Voor een positief resultaat geldt: Salmonella aangetoond.

Voor een negatief resultaat geldt: Salmonella niet aangetoond.

Verdere bevestiging van positieve uitslagen verkregen met de iQ-Check^TM Salmonella II test is ter beoordeling van de gebruiker maar is niet vereist.

Omdat echter in alle gevallen van Salmonella-positieve monsters betreffende het PVE actieplan 2000+ een nadere serotypering van de Salmonella bevinding is vereist, dient met dezelfde BPW-voorophoping als waaruit de PCR is uitgevoerd alsnog een isolatie met MSRV en XLD uitgevoerd te worden volgens PVE-SALMONELLA-MSRV-291009, gevolgd door serotypering van het isolaat (PVE-SALMONELLA-SERO-291009).

8. Controle

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

De iQ-Check^TM Salmonella II test kit bevat een positieve en een negatieve controle. Een additionele interne controle in elk monster bepaald de efficiëntie van de PCR-reactie en is een indicator voor vals-negatieve reacties. Genoemde controles worden in elke test meegenomen.

Ten behoeve van de validatie van het gehele experiment dienen de controles te voldoen aan de volgende eisen, weergegeven in onderstaande tabel. Is dit niet het geval, dan moet de PCR reactie worden herhaald.

	Salmonella detectie	Interne Controle detectie
	(FAM-490)	(HEX)
Negatieve controle	Ct = N/A*	28 < Ct < 40
Positieve controle	26 < Ct < 36	Niet van belang

* De software geeft een Ct waarde ´N/A (not applicable)´ indien de fluorescentie van een monster niet significant boven de achtergrond ruis uitkomt en dus de threshold niet snijdt.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode als geheel dienen te worden meegenomen:

-
Blanco controle,
-
Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),
-
Positieve controle.

9. Opgave van het resultaat

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Geef het resultaat op als ‘Salmonella aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal’ als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht.

Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden (zie bijlage V), dan dient het laboratorium op het analysecertificaat hierover een opmerking te maken en de eventuele gevolgen voor de betrouwbaarheid van de uitslag aan te geven.

10. Bronvermelding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

AFNOR Validation Certificate, iQ-Check^TM Salmonella II, attest BRD-07/06-07/04.
Gebruiksaanwijzing van de iQ-CheckTM Salmonella IITest. Bio-Rad Laboratories b.v., 30 augustus 2007, Veenendaal, NL.
Miras I., Hermant N., Arricau N., Popoff M.Y. Nucleotide sequence of lagA and lagB genes involved in invasion of HeLa cells by Salmonella enterica subsp. Enterica ser. Typhy. Research in Microbiology, Vol. 146 (1): 17-20 (1995).
NEN-EN-ISO 6579:2002. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Horizontale methode voor het aantonen van Salmonella spp. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.
NEN-EN-ISO 7218:2007 En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.
PVE-SALMONELLA-MSRV-291009 . PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van MSRV in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl
PVE-SALMONELLA-SERO-291009. Toelichting op de serotypering van Salmonella volgens het Kauffmann-White schema. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl
Tyagi, S. and Kramer, F.R. Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology 14: 303-308 (1996).

Paragraaf 2. PVE-SALMONELLA-IQ-II-291009: Samenstelling en bereiding van media en reagentia

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

1. Voorophopingsmedium: Gebufferd pepton water (BPw)

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Samenstelling:

Pepton	10,0 g
NaCI	5,0 g
Na₂HP0₄.12H₂0	9,0 g
KH₂P0₄	1,5 g
Water	1000 ml

Bereiding:

-
Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting);
-
Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,0 ± 0,2 bij 25°C bedraagt;
-
Verdeel het medium over daarvoor geschikte flessen of potten;
-
Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121°C).

2. Samenstelling iQ-Check^TM Salmonella II test kit

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Samenstelling:

ID	Reagens	Verstrekte hoeveelheid

A	Lysis reagens	1 fles (20 ml)
B	Fluorescente probes	1 buis (0.550 ml)
C	Amplificatie mix	2 buizen (2 x 2.2 ml)
D	PCR negatieve controle	1 buis (0.5 ml)
E	PCR positieve controle	1 buis (0.250 ml)

De iQ-Check^TM Salmonella II kit, Bio-Rad code 357-8123, bevat reagentia ten behoeve van 96 testen.

Hoofdstuk 7. PVE-CAMPYLOBACTER-PRESTON-140607

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter met behulp van Preston en CCDA in mest en vlees, afkomstig van pluimvee.

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

1. Onderwerp en toepassingsgebied

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in monsters mest en vlees, afkomstig van pluimvee.

2. Definitie

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Campylobacter: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke morfologische, biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze.

3. Principe

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Mestmonsters en blindedarm mestmonsters worden rechtstreeks geënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mCCDA).

Vlees (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) wordt in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 24 uur bebroed bij 41,5°C. Vervolgens wordt afgeënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mCCDA).

Selectieve vaste voedingsbodems worden microaëroob gedurende 48 uur bij 41,5°C bebroed, waarna beoordeeld wordt op aanwezigheid van specifieke kolonies.

Specifieke kolonies worden bevestigd met behulp van oxidase reactie en microscopie. Als extra controle kan een deel van de isolaten met behulp van een latex agglutinatie test worden bevestigd.

4. Reagentia en andere materialen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.1. Algemeen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn.

Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn.

Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218:2007

4.2. Selectief ophopingsmedium: Preston bouillon (zónder paardenbloed)

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.2.1. Preston basismedium

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.2.1.1. Samenstelling

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Vleesextractpoeder^a	10,0 g
Pepton^a	10,0 g
Natrium chloride^a	5,0 g
Natrium pyruvaat^b	0,25 g
Natrium metabisulfiet^b	0,25 g
Ijzer (II) sulfaatb (FeSO₄.7H₂O)	0,25 g
Water	1000 ml

^a ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2

^b ook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. groeisupplement of FBP supplement)

4.2.1.2. Bereiding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).

Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,5 ± 0,2 bij 25 ºC bedraagt.

Steriliseer gedurende 15 minuten bij 121 ºC ± 1 ºC.

4.2.2. Preston antibiotica oplossing

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.2.2.1. Samenstelling

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Polymyxine-B	5000 IU
Rifampicine	0,01 g
Trimethoprim lactaat	0,01 g
Amphotericine-B	0,01 g
Water	4 ml

Opmerking

Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als Preston supplement. Let op, ook het “vroeger” gebruikte Preston supplement, met cycloheximide in plaats van amphotericine-B, is nog steeds verkrijgbaar. De voorkeur wordt echter gegeven aan gebruik van supplement met amphotericine-B.

4.2.2.2. Bereiding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 μm filter)

4.2.3. Compleet Preston ophopingsmedium

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.2.3.1. Samenstelling compleet Preston ophopingsmedium

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Basismedium	1000 ml
Antibiotica oplossing	4 ml

4.2.3.2. Bereiding compleet Preston ophopingsmedium

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Koel het basismedium af tot onder de 47ºC.

Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig.

Opmerking

In de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium wordt paardenbloed gebruikt. In dit voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk is (Jacobs-Reitsma et al., 2003).

4.3. Selectieve voedingsbodem: modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar (mCCDA)

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.3.1. mCCDA Basismedium

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.3.1.1. Samenstelling

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Vleesextractpoeder^a	10,0 g
Pepton^a	10,0 g
Natrium chloride^a	5,0 g
Bacteriologische charcoal	4,0 g
Caseïne hydrolysaat	3,0 g
Natrium deoxycholaat	1,0 g
Ijzer (II) sulfaat (FeSO₄.7H₂O)	0,25 g
Natriumpyruvaat	0,25 g
Agar	12,0 g
Water	1000 ml

^a ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2.

4.3.1.2. Bereiding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).

Indien nodig, stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,4 ºC ± 0,2 bij 25 ºC bedraagt.

Steriliseer gedurende 15 minuten bij 121 ºC ± 1 ºC.

4.3.2. mCCDA antibiotica supplement

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.3.2.1. Samenstelling

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Cefoperazone	32 mg
Amphotericine-B	10 mg
Water	4 ml

Opmerking

Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als mCCDA supplement.

4.3.2.2. Bereiding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 μm filter)

4.3.3. Complete mCCDA voedingsbodem

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.3.3.1. Samenstelling

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Basismedium	1000 ml
Antibiotica oplossing	4 ml

4.3.3.2. Bereiding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Koel het basismedium af tot 47-50 ºC.

Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig.

Giet de agar uit in petrischalen met nok en laat stollen.

4.4. Bevestigingsmedia

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.4.1. Oxidase reagens

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.4.1.1. Samenstelling

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

N,N,N’ ,N’-tetramethyl-1,4-fenyleendiammoniumdichloride	0,1 gram
Water	10 ml

4.4.1.2. Bereiding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Los het N,N,N’ ,N’-tetramethyl-1,4-fenyleendiammoniumdichloride op in het water. Bereid het reagens vlak voor uitvoering van de oxidasetest.

Dit reagens is ook kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar. Handel dan volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.

4.4.2. Latexagglutinatietest voor bevestiging van Campylobacter

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Latexagglutinatietesten voor bevestiging van thermotolerante Campylobacter zijn commerciëel verkrijgbaar.

5. Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria en in het bijzonder de onderstaande:

5.1 Broedstoof voor het bebroeden bij 41,5 ºC ± 1°C.
5.2 Suspendeertoestel, Stomacher
5.3 Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van microaëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen (‘gas-zakjes’).
5.4 Microscoop, bij voorkeur met fase-contrast, vergroting 1000x.

Opmerking

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

6. Werkwijze

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

6.1. Algemeen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Bederfelijke pluimveeproducten dienen gekoeld (1-8°C) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V. De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur na monstername op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na het tijdstip van monstername is verstreken.Stel monsters zo min mogelijk bloot aan temperatuurschommelingen.

Opmerking

Komen mestmonsters mee met vleesmonsters in een koelbox, sla dan alle monsters gekoeld op.

Worden mestmonsters per post ongekoeld verstuurd, sla dan op bij kamertemperatuur, tenzij deze monsters pas de volgende dag worden ingezet.

Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen.Daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan.

In alle gevallen geldt dat de agarplaten na beënten zonder uitstel onder micro-aërobe condities geïncubeerd dienen te worden, omdat Campylobacter obligaat micro-aërofiel is en onder andere omgevingscondities snel afsterft.

6.2. Direct uitplaten

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

6.2.1. Monstervoorbehandeling

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Monsters waarin hoge aantallen Campylobacter worden verwacht, zoals mest en blindedarm, worden rechtstreeks op het isolatiemedium afgestreken.

Maak 1 mengmonster van de 30 afzonderlijke blindedarmen door deze elk op steriele wijze open te knippen en uit elke darm een evenredige hoeveelheid materiaal over te brengen in een lege steriele petrischaal. Meng goed (bijvoorbeeld met een steriele swab of entoog).

6.2.2. Isolatie

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Beënt vanuit het mengmonster met behulp van de swab of entoog een halve mCCDA-plaat.

Beënt de rest van de plaat door middel van verdunningsstrepen met behulp van een steriele öse, zodanig dat na incubatie losliggende kolonies kunnen ontstaan.

Incubeer mCCDA platen micro-aëroob gedurende 48 uur ± 4 uur bij 41,5 °C ± 1°C.

6.3. Ophoping

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

6.3.1. Monstervoorbehandeling

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Breng 25 gram ± 1 gram van het monster, bijvoorbeeld een stuk huid van de borstkap of filet, in een stomacherzak en voeg 100 ml Preston bouillon toe. Stomacher gedurende 1 minuut en scheidt het monstermateriaal van de ophopingsbouillon (bijvoorbeeld door het verwijderen van de binnenzak van de stomacherzak met daarin het monstermateriaal of door overschenken van de ophopingsvloeistof in een schoon steriel flesje).

6.3.2. Ophoping

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Incubeer de ophopingsbouillon 24 uur ± 2 uur bij 41,5 °C ± 1°C in micro-aëroob milieu.

Indien geïncubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. </= 2 cm), kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden.

6.3.3. Isolatie

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Beoordeel bebroede mCCDA-platen op de aanwezigheid van kolonies met de volgende morfologische eigenschappen: grijs, metalig, laag convex, amorf en de neiging om met de entstreep mee te groeien. Deze kolonies worden als verdacht positief aangemerkt.

7. Bevestiging

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

7.1. Algemeen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Voer de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 verdachte kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 verdachte kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur, totdat een positief resultaat wordt verkregen. Ter bevestiging wordt een oxidase reactie uitgevoerd en worden de verdachte kolonies microscopisch beoordeeld. Voer zonodig eerst een reinstrijk uit op bijvoorbeeld een bloedplaat of een mCCDA-basis agar plaat (zonder antibiotica supplement).

7.2. Oxidase reactie

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Ent met een entoog (anders dan van nikkel/chroom) vanaf de mCCDA plaat een verdachte kolonie op een filtreerpapiertje bevochtigd met oxidasereagens. Lees na maximaal 10 seconden de reactie af. De reactie is positief bij paarskleuring en negatief indien er geen verkleuring optreedt.

7.3. Microscopie

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Maak van de verdachte kolonie een hangende-druppel-preparaat of nat-preparaat en beoordeel met een fasecontrast of donkerveld microscoop (100x objectief) op de karakteristieke kurketrekker-vormige morfologie en grote beweeglijkheid van Campylobacter. Bij kleuring volgens Gram tonen Campylobacter bacteriën zich als kurketrekker-vormig gebogen Gramnegatieve staafjes. De karakteristieke vorm is ook goed te zien bij kleuring met Oost-Indische inkt. Bij oude culturen (> 2 dagen op plaat) kan Campylobacter coccoïde en minder beweeglijke vormen aannemen.

7.4. Aanvullende bevestiging

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Bij twijfel of als extra controle op de juiste identificatie wordt aanbevolen om regelmatig een aanvullende bevestiging uit te voeren met een latexagglutinatietest, bijvoorbeeld met 1 op 50 bevestigde kolonies.

7.4.1. Latexagglutinatietest

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Latexagglutinatietesten zijn bij diverse firma s commercieel verkrijgbaar en moeten volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant worden uitgevoerd en afgelezen.

7.5. Interpretatie bevestigingsreacties

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Campylobacter bacteriën vertonen de karakteristieken zoals omschreven in tabel 1.

Tabel 1- Karakteristieken van Campylobacter
Test	Omschrijving	Campylobacter-specifiek resultaat
Microscopie	Karakteristieke kurketrekkervormige morfologie en grote beweeglijkheid	+
Oxidase	Paarsvorming	+
Latexagglutinatie	Volgens voorschrift fabrikant	+

8. Controle

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:

-
Blanco controle,
-
Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),
-
Positieve controle.

9. Opgave van het resultaat

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Geef het resultaat op als ‘Campylobacter aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal’ als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht.

10. Bronvermelding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Jacobs-Reitsma, W. (1994). Epidemiology of Campylobacter in Poultry. Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands.
Jacobs-Reitsma W., M. van der Wal, R. Achterberg and J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation A-12 at the 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, September 2003, Aarhus, Denmark. Intern. J. of Med. Microbiol., Vol. 293 Suppl. 35, p. 6-7.
NEN-EN-ISO 10272:1995. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of thermotolerant Campylobacter + technical corrigenda (ISO10272:1995/Cor.1:1996(E) and ISO 10272:1995/Cor:1997(E). Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.
NEN-EN-ISO 7218:2007 En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

Hoofdstuk 8. PVE-CAMPYLOBACTER-VIDAS-140607

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. met behulp van VIDAS CAM in vlees, afkomstig van pluimvee.

1. Onderwerp en toepassingsgebied

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in vlees, afkomstig van pluimvee.

2. Definitie

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Campylobacter: alle typen Campylobacter waarvan de specifieke antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.

3. Principe

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

VIDAS CAM is een enzym immunoassay voor de detectie van Campylobacter antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en die geautomatiseerd wordt uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat.

Pluimveevlees (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) wordt in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 48 uur bebroed bij 41,5°C. Vervolgens wordt de VIDAS CAM assay uitgevoerd. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 70 minuten beschikbaar. Verdere bevestiging van positieve uitslagen is niet noodzakelijk.

4. Voedingsmedia

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.1. Algemeen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn.

Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn. Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218:2007.

4.2. Selectief ophopingsmedium: Preston bouillon (zónder paardenbloed)

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.2.1. Preston basismedium

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.2.1.1. Samenstelling

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Vleesextractpoeder^a	10,0 g
Pepton^a	10,0 g
Natrium chloride^a	5,0 g
Natrium pyruvaat^b	0,25 g
Natrium metabisulfiet^b	0,25 g
IJzer (II) sulfaat^b (FeSO₄.7H₂O)	0,25 g
Water	1000 ml

^a ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2

^b ook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. groeisupplement of FBP supplement)

4.2.1.2. Bereiding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).

Stel de pH zo in dat deze na sterilisatie 7,5 ± 0,2 bedraagt bij 25ºC.

Steriliseer gedurende 15 minuten bij 121 ºC ± 1ºC.

4.2.2. Preston antibiotica oplossing

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.2.2.1. Samenstelling

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Polymyxine-B	5000 IU
Rifampicine	0,01 g
Trimethoprim lactaat	0,01 g
Amphotericine-B	0,01 g
Water	4 ml

Opmerking

4.2.2.2. Bereiding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 μm filter).

4.2.3. Compleet Preston ophopingsmedium

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

4.2.3.1. Samenstelling compleet Preston ophopingsmedium

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Basismedium	1000 ml
Antibiotica oplossing	4 ml

4.2.3.2. Bereiding compleet Preston ophopingsmedium

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Koel het basismedium af tot onder de 47ºC.

Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig.

Opmerking

5. Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria en in het bijzonder de onderstaande:

5.1 Broedstoof voor het bebroeden bij 41,5 ºC ± 1°C.
5.2 Suspendeertoestel, Stomacher
5.3 Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van micro-aëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen (‘gas-zakjes’).

bijvoorbeeld:

GenBox micro-aërofiel (10 zakjes, ref. 96125, bioMérieux).
5.4 VIDAS of mini VIDAS analyser (bioMérieux).
5.5 VIDAS CAM assay (30 testen, ref. 30111, bioMérieux)

Opmerking

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

6. Werkwijze

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-8°C) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V.

De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur na monstername op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na het tijdstip van monstername is verstreken.

Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen. Daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan.

6.1. Monstervoorbehandeling

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

6.2. Ophoping

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Incubeer de ophopingsbouillon 48 uur ± 2 uur bij 41,5 ºC ± 1°C in micro-aëroob milieu. Indien geïncubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. </= 2 cm), kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden.

6.3. Detectie

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Meng het ophopingsmedium na incubatie en breng 2 ml over in een eppendorfbuisje. Sluit de buisjes en verhit gedurende 15 minuten in een kokend waterbad. Voer vervolgens de VIDAS CAM test uit volgens de gebruiksaanwijzing. Runtime VIDAS CAM test bedraagt ongeveer 70 minuten.

Opmerking

Indien de VIDAS CAM test niet direct kan worden uitgevoerd is het mogelijk de ophoping (of een deel ervan) in te vriezen voor maximaal 48 uur. Na ontdooien moet de ophoping opgekookt worden en kan bovenstaande werkwijze worden gevolgd.

6.4. Beoordeling van VIDAS CAM resultaten

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CAM test. Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar een zogenaamde Test Value (TV). Resultaten met een TV onder de 0,1 betreffen monsters waarin Campylobacter antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten met een TV = 0,1 worden als Campylobacter-positief gerapporteerd.

7. Bevestiging

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

De in dit voorschrift beschreven VIDAS CAM methode is een detectie methode. Verdere confirmaties zijn niet nodig.

8. Controle

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

De VIDAS CAM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CAM test.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode als geheel dienen te worden meegenomen:

-
Blanco controle,
-
Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),
-
Positieve controle.

9. Opgave van het resultaat

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

10. Bronvermelding

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, E. Samuëls and J. Wagenaar. Evaluation of the VIDAS Campylobacter Assay for detection of Campylobacter in fresh poultry products after various enrichment methods. Posterpresentation A-18 at 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, September 2003, Aarhus, Denmark. Intern. J. Med. Microbiol., Vol. 293 Suppl. 35, p. 6.
Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, R. Achterberg, J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation A-21 at 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, September 2003, Aarhus, Denmark. Intern. J. Med. Microbiol., Vol. 293 Suppl. 35, p. 6-7.
NEN-EN-ISO 7218:2007 En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.
PVE-CAMPYLOBACTER-PRESTON-140607 . PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter met behulp van Preston en CCDA in mest en vlees, afkomstig van pluimvee. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl
Samuëls, E.L.A.M. en W. Jacobs-Reitsma, Validatierapport van de Campylobacter bepaling in de matrix pluimveevlees met behulp van de VIDAS CAM methode. (Onderzoek in het kader van het PVE Plan van Aanpak/Actieplan 2000+ Salmonella en Campylobacter in de pluimveesector), april 2004.

Bijlage V. Ontvangst van monsters en registratie van afwijkingen

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Indien afwijkingen in de voorgeschreven kwaliteit en wijze van aanleveren van monsters zijn geconstateerd, moet in ieder geval bij de volgende punten aan de opdrachtgever worden gemeld dat er in de procedure van monstername en inzenden een afwijking is geconstateerd. Ook moet worden gemeld welke afwijking het betreft.

Ten algemene:

-
Indien bij de inzending één van de volgende gegevens ontbreekt: monsterdatum en tijdstip, stalnummer en KIP-nummer.
-
Indien monsters niet deugdelijk zijn verpakt in monsterpotten of zakken.
-
Indien monsters zodanig zijn geadresseerd dat voor transporteur en laboratorium verwarring kan ontstaan.
-
Indien er tussen het tijdstip van monstername en het tijdstip van ontvangst op het laboratorium meer dan 48 uur is verstreken.

Monsters.

Inlegvellen (opfokbedrijven, opfokvermeerderingsbedrijven en vleeskuikenbedrijven):

a) Indien onvoldoende inlegvellen worden aangeleverd.
b) Indien de monsters inlegvellen onvoldoende groot zijn.
c) Indien de monsters inlegvellen niet duidelijk met mest zijn besmeurd.

Dons (broederijen):

a) Indien het monster niet minimaal 25 gram dons bevat.
b) Indien het monster geen natte dons bevat.

Mest (swabs, mestmonsters of overschoentjes) ((op)fokvermeerderingsbedrijven, vermeerderingsbedrijven, vleeskuikenbedrijven, opfoklegbedrijven, legeindbedrijven, vleeskalkoenbedrijven en kalkoen vermeerderingsbedrijven):

Mestmonsters:

a) Indien onvoldoende mestmonsters (2 keer 150 gram) worden aangeleverd.

Swabs:

a) Indien onvoldoende swabs worden aangeleverd.
b) Indien de swabs onvoldoende met mest zijn besmeurd.
c) Indien de swabs niet tot twee mengmonsters zijn gepoold (tenzij de swabs individueel zijn verpakt).

Overschoentjes:

a) Indien per stal onvoldoende overschoentjes zijn aangeleverd (2 paar bij vleeskuikenbedrijven, 5 paar bij fok- vermeerderingsbedrijven en 2 paar gepoold tot 1 monster bij opfokleg en legbedrijven).
b) Indien de overschoentjes niet duidelijk met mest zijn besmeurd.

Blindedarmmest (slachterijen):

a) Indien niet minimaal 30 blindedarm monsters zijn genomen.
b) Indien de blindedarm monsters van onvoldoende formaat zijn.

Borstkapvellen (slachterijen):

a) Indien het monster vel van de borstkap niet minimaal 25 gram weegt.
b) Indien het monster niet gekoeld (1-8 °C) getransporteerd en bewaard is.

Eindproducten (slachterijen/uitsnijderijen):

a) Indien het monster eindproduct niet minimaal 25 gram weegt.
b) Indien het monster niet gekoeld (1-8 °C) getransporteerd en bewaard is.

Bijlage VI. Normen Salmonella detectie-ringonderzoek, Salmonella serotypering-ringonderzoek en Campylobacter detectie-ringonderzoek

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

A. Norm Salmonella detectie-ringonderzoek

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Monsters met Feces

· blanco’s:	min.	80 % negatief
· hoog besmette capsules:	min.	80 % positief
· laag besmette capsules:	min.	50 % positief

Controles

· blanco’s:		100 % negatief
· hoog besmette capsules:		100 % positief
· laag besmette capsules:	min.	50 % positief

Indeling

Goed: Als aan bovenstaande eisen voldaan wordt
Onvoldoende: Als niet aan bovenstaande eisen voldaan wordt

Consequenties

Goed: Geen consequenties
Onvoldoende: Extra monsters worden nagestuurd. Wanneer bij dit extra onderzoek onvoldoende gepresteerd wordt, wordt het laboratorium geschorst voor de detectie van Salmonella totdat de resultaten bij een volgend ringonderzoek detectie Salmonella van het NRL ‘goed’ zijn.

B. Norm Salmonella serotypering-ringonderzoek

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Voor de beoordeling van de fouten wordt uitgegaan van de opgegeven lijst van te typeren stammen per laboratorium.

Onderverdeling in grove fouten en kleine fouten. Per grove fout krijgt het laboratorium 2 punten en per kleine fout 1 punt. Het totale aantal punten bepaalt hoe het laboratorium gescoord heeft bij het ringonderzoek.

Geen fout
- -
  Typering derden voor stammen die niet op de opgegeven lijst staan
- -
  Niet volledig uittyperen van stammen die niet op de opgegeven lijst staan
Kleine fouten (1 punt)
- -
  Typering derden voor stammen die op de opgegeven lijst staan
- -
  Serotype naam fout, maar groep goed van stammen die niet op de opgegeven lijst staan
Grove fouten (2 punten)
- -
  Serotype naam fout en groep fout (ongeacht of het serotype op de lijst staat of niet)
- -
  Serotype naam fout van stammen die op de opgegeven lijst staan
- -
  Niet volledig uittyperen van stammen die op de opgegeven lijst staan
- -
  Onterecht S. Enteritidis of S. Typhimurium afgeven

Indeling

Goed: 0 – 1 punt
Matig: 2 – 4 punten
Onvoldoende: meer dan 4 punten

Consequenties

Goed: Geen consequenties.
Matig: Advies kan worden opgevraagd bij het NRL voor Salmonella serotypering.
Onvoldoende: Extra set stammen wordt nagestuurd. Wanneer bij dit extra onderzoek onvoldoende gepresteerd wordt, wordt het laboratorium geschorst voor het typeren totdat de resultaten bij een volgend ringonderzoek serotypering Salmonella van het NRL ‘matig’ of ‘goed’ zijn.

C. Norm Campylobacter detectie-ringonderzoek

[Regeling vervallen per 01-01-2015]

Kleine fouten (1 punt)
- -
  Campylobacter-positieve blinde darminhoud foutief beoordeeld
- -
  Campylobacter-positief borstvel foutief beoordeeld
Grove fouten (2 punten)
- -
  Reincultuur foutief beoordeeld
- -
  Campylobacter-negatieve blindedarminhoud foutief beoordeeld

Indeling

Goed: 0 – 1 punt
Matig: 2 – 4 punten
Onvoldoende: meer dan 4 punten

Consequenties

Goed: Geen consequenties.
Matig: Advies kan worden opgevraagd bij het NRL voor Campylobacter.
Onvoldoende: Extra set stammen wordt nagestuurd. Wanneer bij dit extra onderzoek onvoldoende gepresteerd wordt, wordt het laboratorium geschorst voor het typeren totdat de resultaten bij een volgend ringonderzoek serotypering Salmonella van het NRL ‘matig’ of ‘goed’ zijn.