6. Werkwijze
[Regeling vervallen per 17-09-2005]
6.1. Voorbereiding van het analysemonster
[Regeling vervallen per 17-09-2005]
6.1.1. Indien het vetgehalte van het monster meer dan 5% m/m bedraagt dient het monster ontvet te worden.
Indien het vetgehalte onbekend is verdient het aanbeveling steeds een vetextractie
toe te passen. Weeg tot op 0,01 g nauwkeurig 10 g van het monster af in een bekerglas
van 250 ml. Voeg toe 25 ml petroleumether. Roer gedurende 15 minuten, met behulp van
een magneetroerder (5.11.). Laat gedurende enkele minuten bezinken en schenk de petroleumetherlaag
voorzichtig af.
Herhaal deze procedure twee maal. Plaats het bekerglas gedurende een nacht in de vacuumdroogstoof
(5.1.) bij 70°C±1°C. Bepaal het massaverlies.
6.1.2. Maal zonodig het ontvette monster met behulp van de laboratoriummolen (5.2.)
tot een poeder met een deeltjesgrootte van 0,3–0,5 mm.
6.2. De bepaling
[Regeling vervallen per 17-09-2005]
6.2.1. Weeg in tweevoud tot op 0,1 mg nauwkeurig ongeveer 1 g van het analysemonster(6.1.2.)
in een bekerglas van 400 ml(hoog model). Voeg aan ieder bekerglas toe 50 ml fosfaatbufferoplossing
(4.2.2.). Voeg toe 100 microliter Termanyloplossing (4.1.5.).
Dek de bekerglazen af met aluminiumfolie en plaats gedurende 15 minuten in het kokende
waterbad (5.7.). Zwenk iedere 5 minuten om. De temperatuur van de inhoud van de bekerglazen
dient ongeveer 100°C te bereiken. Verleng zonodig de incubatietijd (30 minuten is
meestal voldoende).
Koel af tot kamertemperatuur en stel de Ph in op 7,5±0,1 door toevoeging van ongeveer
10 ml natriumhydroxyde oplossing 0,285 mol/l (4.2.3.).
6.2.2. Voeg toe 5 mg protease (4.1.6.). Maak daartoe een oplossing met een bekend
gehalte en pipetteer de benodigde hoeveelheid.
Dek de bekerglazen af met aluminiumfolie en plaats ze gedurende 30 minuten in het
schudwaterbad (5.8.) bij 60°C±1°C.
Koel af tot kamertemperatuur en stel de pH in op 4,5±0,2 met ongeveer 10 ml fosforzuur
0,329 mol/l (4.2.4.).
6.2.3. Voeg toe 0,3 ml amyloglucosidaseoplossing (4.1.7.).
Dek de bekerglazen af met aluminiumfolie en plaats ze gedurende 30 minuten in het
schudwaterbad (5.8.) 60°C±1°C.
6.2.4. Neem de bekers uit het waterbad en voeg toe 280 ml ethanol 95% v/v(4.1.1.),
voorverwarmd op 60°C±1°C. Laat gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur staan voor
de vorming van het neerslag.
6.2.5. Breng in de Pyrexfilterkroezen (5.10.) 0,5 celite 545(4.1.10.). Droog de filterkroes
met celite in de droogstof (5.4.) tot constant gewicht. Koel af in de exsiccator (5.6.)
en weeg tot op 0,1 mg nauwkeurig.
6.2.6. Spreid vervolgens de celite gelijkmatig over de bodem van de filterkroes met
behulp van een spuitfles gevuld met ethanol 71% v/v (4.1.11.). Zuig voorzichtig af. De gelijkmatige celitelaag vormt een afscheiding
tussen de af te filtreren vezel en de gesinterde bodem van de filterkroes. Hierdoor
kan de inhoud van de kroes gemakkelijk verwijderd worden.
6.2.7. Filtreer, zo nodig onder afzuiging, het reactiemengsel (6.2.4.) door de filterkroes(6.2.6.).
Was het residu drie maal met telkens 20 ml ethanol 71% v/v (4.2.1.), vervolgens twee maal met telkens 10 ml ethanol 95% v/v (4.1.1.) en twee
maal met telkens 10 ml aceton (4.1.2.).
6.2.8. Droog de filterkroes met inhoud gedurende een nacht bij 70°C±1°C in de vacuumdroogstof
(5.1.) of bij 103°C±2°C in de droogstof (5.4.). Koel af tot kamertemperatuur in de
exsiccator (5.6.) en weeg tot op 0,1 mg nauwkeurig.
6.2.9. Bepaal in één van de filterresiduen het gehalte aan eiwit volgens de Kjeldahl
methode.
Schraap hiertoe de celite en vezel uit een van de filterkroezen op een stikstofvrij
filtreerpapier, vouw dit dicht en breng het zo in de Kjeldahldestructiekolf. Gebruik,
indien de aard van het eiwit bekend is, de bijbehorende factor. Is de aard van het
eiwit onbekend, gebruik dan de factor 6,25.
6.2.10. Plaats de tweede kroes in de moffeloven (5.5.) en veras bij 525°C±25°C gedurende
5 uren. Koel af in de exsiccator (5.6.) en weeg tot op 0,1 mg nauwkeurig.
6.2.11. Voer een blanco bepaling in tweevoud uit teneinde de bijdrage van de gebruikte
chemicaliën aan het resultaat vast te stellen.
